アブストラクト

グルコース毒性による膵島の損傷は、2型糖尿病の病因に関係しているが、膵島細胞機能不全および高血糖症に至る一連のイベントは不明のままである。基礎グルコース負荷の増加に起因する膵島病理の初期段階を調べるために、正常な覚醒ラットに10日間連続してグルコースを注入した。血漿グルコースと膵島および肝機能のマーカーは、注入全体を通してモニターされました。最初の高血糖後、ラットは注入に適応し、約4日間正常血糖を維持しました。注入を継続すると、6日間でラットのわずか5％で高血糖が悪化しましたが、基礎および刺激された血漿インスリンおよびCペプチド濃度は変化していませんが、8日間で69％、10日間で89％になりました。対照的に、血漿グルカゴン濃度は5倍に増加しました。-1・分-1で0日、P <0.001）が、間に三倍日4及び8（9.9±1.7ミリグラム・キログラム-1・分-1、P <0.01）。驚くべきことに、EGPの増加は、サイトゾルアイソフォームの適切な抑制を伴うミトコンドリアホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ発現の増加を伴っていました。抗グルカゴン抗体の注入により、血漿グルコースが4日目と同じレベルに正常化されましたおよび対照よりも約300 mg / dl低い。この改善された血糖はEGPの60％の減少と関連付けられました。これらのデータは、グルコースの毒性がインスリン分泌の測定可能な不足の前に最初にα細胞機能障害として現れるという新しい概念をサポートしています。このような高グルカゴン血症は、グルコースの恒常性を維持するβ細胞の能力を圧倒する過剰なグルコース産生につながる可能性があります。

キーワード：グルカゴン、肝グルコース産生、2型糖尿病

2型糖尿病（T2D）への進行の初期段階の根底にあるメカニズムは完全には理解されていません。不適切に上昇した内因性グルコース産生（EGP）はhyperglucagonemiaに関連付けられた増加新生から主に誘導された糖尿病（への進行における早期の特徴である16、27、28）。血漿グルコースへの食事による周期的および中断的な性質とは異なり、EGPはグルコースプールに継続的に寄与することができます。その結果、増加したEGPを処理するために必要な1日を通してインスリン分泌が持続的に増加すると、膵島細胞の「基礎作業量」が増加します。メカニズムは明確ではありませんが、高グルカゴン血症も患者で十分に実証されています（2、31、33）、および動物モデル（17、19、35、38）高インスリン血症および低インスリン血症の両方を伴う糖尿病、およびそれはEGPを増強することにより高血糖に寄与する。糖尿病患者とほとんどの動物モデルにおける複数の生理学的異常のため、血糖コントロールの喪失に対する高グルカゴン血症の相対的な寄与を決定することは困難です。この研究では、正常で健康なラットの膵島αおよびβ細胞機能に対する持続的なグルコース負荷の影響を調べました。グルコース注入ラットでは、8日後に高血糖、高グルカゴン血症、および過剰な肝臓グルコース産生が発生しました。我々の研究は、不適切に上昇したグルカゴンレベルが低インスリン血症は、ストレプトゾトシン処理（起因と同時に発生した動物実験と対照的である7、8、30）そして、高グルカゴン血症および不適切な肝臓グルコース出力は、高インスリン血症の状況でさえ高血糖症の原因となる役割を果たす可能性があることを意味します。

慢性、静脈、ブドウ糖注入（CIGI）ラットモデルを使用して、ブドウ糖の出現率の持続的な増加自体が膵島機能を損なうかどうかを評価しました。CIGIラットの利点は、β細胞機能を損なうか、インスリン抵抗性を増加させることによりグルコースの外観を高めるモデルとは異なり、グルコース負荷の増加の効果が直接的であることです。注入用と血漿サンプリング用の2つの静脈内カテーテルを、食物と水を自由に摂取できる健康な覚醒状態の成体Sprague-Dawleyラットに入れました。ラットに、グルコースまたは等量の半生理食塩水を10日間注入しました。CIGIラットは注入に徐々に順応し、4日目に血糖の新しい定常状態を達成しました。これは注入の8日目まで一貫して高血糖を発症し、高インスリン血症の状況における高グルカゴン血症、および過剰な肝臓グルコース産生。ここでは、適応から顕性高血糖への移行中のCIGIラットの発見を報告します。

材料および方法

動物

体重約300 gの正常なオスのSprague-Dawleyラット（マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールズリバー）を12:12時間の暗所で飼育しました。動物はそれぞれ、50ゲージおよび90ゲージのポリエチレンチューブを使用して、大腿静脈および頸静脈カテーテルを留置する手術を受け、個々のケージで3日間以上回復させました。ラットを利用し、柔軟なバネで保護された2つのカテーテルを、バランスの取れたレバーアーム（ペンシルバニア州プリマスミーティングのInstech Solomon）のデュアルチャネルスイベルに取り付けました。この配置により、rod歯動物は注入中にケージに完全にアクセスできました。キャリブレーション済みシリンジポンプ（ハーバード装置、マサチューセッツ州ホリストン）を使用して、0.49％NaClまたは2.5（CIGI-low）または3.3（CIGI-high）g / kg -1・h -1の同じ一定速度ですべてのラットに注入しました。試験中、50ゲージカテーテルを通してデキストロース（それぞれ0.35および0.5 g / ml）。生理食塩水の代わりに半生理食塩水を使用して、大きなナトリウム負荷でレニン-アンジオテンシン系を活性化する可能性を減らし、交絡生理学的変化をもたらしました。90ゲージのカテーテルから毎日の血液サンプルを収集し、アプロチニンを含む事前に冷却したチューブに入れました。血漿を遠心分離により分離し、-80℃で保存しました。Razelポンプ（Mansfield、St。Albans、VT）を使用して、ヘパリン添加生理食塩水（1.25 U / h）を一定（0.25 ml / h）注入することで、採血カテーテルの開通性を維持しました。通常の食事（Harlan-Teklad 2018、77％炭水化物-5％脂肪-18％タンパク質）の摂取は毎日モニターされました。1日の総カロリー摂取量は、消費された固形飼料の栄養組成と注入からの追加のカロリー入力に基づいて計算されました。ラットは指定された場所で一晩（14?16時間）絶食させた。すべてのプロトコルは、エール大学動物管理使用委員会によって承認されました。

血漿の生化学的分析

血漿グルコース濃度は、Beckman Glucose Analyzer II（Beckman Instruments、Fullerton、CA）でグルコースオキシダーゼ法を使用して測定しました。インスリンは、通常の範囲のELISAキット（Mercodia、スウェーデン、ウプサラ）を使用して測定されました。グルカゴンとアミリンは、LINCOplexアッセイ（Millipore、Billerica、MA）で測定しました。C-ペプチドおよびコルチコステロンは、RIA（Millipore）を介して測定されました。COBAS MIRA Plus（Roche Diagnostics、Pleasanton、CA）を使用して、血漿トリグリセリド、非エステル化脂肪酸、ナトリウム、カリウム、塩化物、アルブミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ、およびケトン濃度を測定する化学分析を実施しました。

EGP

前に一晩絶食後0日、4、または8、活かしたラットは、グルコース注入の中止せずに基底状態に集め3つの血漿サンプルであった（-30、-20、-5分）。0日目ラットは、99％濃縮[6,6 2 H 2 ]グルコースの初回刺激連続注入を受けました（初回刺激3.0 mg・kg -1・分-1 ×5分、連続0.3 mg・kg -1・分-1 × 90分）。CIGI-highラットも3.0 mg.kg -1・min -1のプライムを受けましたが、3.3 g・kg -1・h -1天然の豊富なグルコースの連続注入は、注入速度を変更することなく、5％[6,6- 2 H 2 ]グルコースに変更されました。60、75、および90分で定常状態に達した後、血漿が得られました。サンプルを5容量の100％メタノールで除タンパクし、乾燥し、1：1無水酢酸-ピリジンで誘導体化して、グルコースの五酢酸誘導体を生成しました。グルコースM + 1およびM + 2の原子パーセント濃縮は、電子イオン化モードで動作するHewlett-Packard 5971A質量選択検出器に接続されたHewlett-Packard 5890ガスクロマトグラフを使用するGC-MSで測定しました（3）。グルコースM + 1およびM + 2の濃縮は、それぞれ質量電荷比201?200および202?200から決定されました。EGPはSteeleの式（39）。

静脈内ブドウ糖負荷試験

ラットを事前に静脈内グルコース負荷試験（IVGTTs）に一晩絶食させた0日、4、または8。1 g / kgのブドウ糖ボーラスを大腿静脈カテーテルから投与し、血漿グルコースとインスリン濃度の測定のために、0、2.5、5、10、15、20、30、45、60、および90分でサンプルを収集しました。基礎グルコース注入速度は変化しなかった。曲線（AUC）下のインスリン面積時点（時刻A）以降の時刻b（時間B下記の式を用いて計算した）：総インスリンAUC =Σ[（時間 - 時間B）半×（インスリンa +インスリンb）]。ベースラインのインスリンAUCおよびベースラインを超えるインスリンAUCは、次のように計算されました。ベースラインインスリンAUC = 90分×インスリン時間0、ベースラインを超えるインスリンAUC =総インスリンAUC-ベースラインインスリンAUC。第一相インスリンAUCは、上記の式を使用して0?15分のデータで計算されました。

グルカゴン抗体研究

8日目の終夜の絶食後、絶食した高血糖ラット（血漿グルコース?200mg / dl）でEGPアッセイを実施しました。その直後に、抗グルカゴンまたは対照抗体（抗DNP、4 mg / kg）の静脈内注射が投与された（ノボノルディスクの西村エリカからの親切な贈り物）。6時間後、2回目のEGPアッセイを実施しました。グルコース注入を継続し、血漿グルコースおよびインスリン測定のための抗体治療の24時間後に血漿を得た。動物は直ちに安楽死させられた。

組織分析

注入の終わりに、ペントバルビタールナトリウムを使用して動物を安楽死させ、組織をその場で採取し、液体窒素浴で凍結した。サンプルは、事前に冷却した乳鉢と乳棒で粉末にし、さらに処理するために-80℃で保存しました。肝臓のグリコーゲン含有量は、肝臓ホモジネートをアミログルコシダーゼで消化し、得られたグルコース濃度をベックマングルコースアナライザーで測定することにより測定しました（18）。肝臓トリグリセリドは、DCLトリグリセリド試薬（Diagnostic Chemicals、オックスフォード、CT）を使用して測定しました。液体クロマトグラフィー-質量分析-質量分析を実施して、前述のように長鎖脂肪アシルCoAおよびジアシルグリセロール含量を測定しました（44）。肝臓のmRNAレベルを測定するため、Qiacube（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を使用してcDNAを抽出し、Peltier Thermal Cycler（MJ Research、ウォルサム、マサチューセッツ州）で逆転写を行いました。7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems、Foster City、CA）を使用してmRNAを定量しました。肝臓タンパク質をウエスタンブロットで検出し、4?12％Tris-glycineゲル（Invitrogen、Carlsbad、CA）に30?50μgのタンパク質溶解物をロードし、ポリフッ化ビニリデン膜（Millipore）に転写しました。膜は、ヒツジポリクローナル細胞質ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK-C）抗体（ヴァンダービルト大学メディカルセンターのダリル・グラナーからの親切な贈り物）およびヤギ抗ミトコンドリアホスホエノールとともにインキュベートされましたピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK-M）抗体（Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）。ウサギ抗グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（Abcam）をローディングコントロールとして使用しました。ブロットは、Adobe Photoshop CS4（Adobe Systems、San Jose、CA）ソフトウェアを使用して開発および定量化されました。

統計とデータ分析

このモデルの技術的課題のため、この研究は分析を扱う意図として実施されました。輸液ラインが失われた場合、すべてのデータはラインが閉鎖されるまで維持されました。同様に、サンプリングラインが研究の途中で失われた場合、注入は継続されましたが、rod歯類はエンドポイント組織分析研究にのみ使用されました。すべてのデータは平均±SWとして報告されます。対応のない両側スチューデントt検定と一元配置分散分析は、Prismソフトウェアパッケージバージョン5（GraphPad、ラホーヤ、カリフォルニア州）を使用して実行されました。混合モデル分析は、IPSSソフトウェアパッケージを使用して実行されました。差はP <0.05で有意であると見なされました。

結果

CIGIラットは、食物摂取量の減少を補うことで、総カロリーバランスがわずかに増加しています。 2.5および3.3 g・kg -1・h -1（それぞれCIGI低およびCIGI高）の両方でグルコースを注入したラットは、実験期間中、生理食塩水を注入したコントロールと比較して、カロリーバランスが平均で45％増加しました。 （図1 A）。両方のCIGIグループは、グルコース注入の速度に反比例して注入開始時の食事摂取量を有意に減少させたため、合計カロリーバランスに差はありませんでした。総炭水化物バランスは、CIGIラットでほぼ2倍で、CIGI 低群と高群の間で差はありませんでした（P = 0.35）（図1 B）。

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図1

グルコースまたは生理食塩水の注入の最初の8日間のカロリー摂取。A：グルコース注入と食物消費を含む、毎日のカロリー摂取量。統計は、総カロリー摂取量です[ n = 17生理食塩水注入、7慢性、静脈内、ブドウ糖注入（CIGI）低、および40 CIGI高ラット]。B：毎日の炭水化物摂取。*** 生理食塩水に対してP <0.001。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析を使用して、有意性を判定しました。この図および以下のすべての図では、データは平均値±標準誤差として示されています。NS、重要ではありません。

適応後、CIGI-highラットは高血糖を発症します。

生理食塩水注入の期間を通して、摂食した血漿グルコースまたはインスリン濃度に有意な変化はありませんでした（図2、AおよびB）。対照的に、注入の1日目に、両方のCIGIグループは有意な高血糖を経験しました。4日目、両方のグルコース注入の基により血糖値<が200mg / dlと最下点との新たな定常状態を確立した5日目（CIGIロー179±9 CIGI高171±4ミリグラム/ DL対MG / DL 、P = 0.53）、生理食塩水を注入したラットと比較して、わずかに上昇しただけでした（147±8 mg / dl、P <0.05）（図2 A）。グルコースの恒常性の改善は、インスリンの着実な減少を伴っていました（図2 B）が、食物摂取の変化はありませんでした。CIGI-lowラットは、10日間の注入期間を通して「適合した」血漿グルコースレベルを維持し、血漿インスリン濃度は徐々に低下しました。対照的に、CIGI-lowラットと同じ適応血漿グルコース濃度を持っているにもかかわらず、7日目から始まるCIGI-highラットは、血漿インスリンレベルの増加とともに、徐々に高血糖になりました。7日目 CIGI高ラットの平均血漿インスリンレベルが二倍CIGI低ラット（230±39対116±13μU/ mlであったP <0.001）及び10倍の生理食塩水群のそれ（22±7 μU/ ml、P<0.001）。適応期間後（4日目以降）、研究終了時までに高血糖になった対照ラットはありませんでした（つまり、グルコース?200mg / dl）。一方、CIGI低の14％およびCIGIの89％ -高ラットは高血糖でした。

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図2

対照およびCIGIラットの毎日の非空腹時グルコースおよびインスリン。A：毎日の血漿グルコース濃度。B：毎日の血漿インスリン濃度。○、CIGI-high; ?、CIGI-low; ●、生理食塩水。* P <0.05、CIGI高vs CIGI低; ** P <0.01、CIGI高vs CIGI低; *** P <0.001、CIGI高vs CIGI低; § P <0.05、CIGI高食塩水対。§§ P <0.01、CIGI高食塩水対。§§§ P <0.001、CIGI高食塩水対。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析を実行して、有意性を判定しました。

高血糖への移行期のCIGI高ラット

より詳細な調査のために適応と高血糖の間の移行をターゲットにするために、注入の4日目と8日目がより詳細な研究のために選択されました。これらの日は、すべてのCIGI高ラットが4日目に適応し、69％が8日までに明白な高血糖を発症し、11％を除くすべてが次の2日間で高血糖になるため、悪化する高血糖への進行中の重要なポイントを表します。ベースラインおよび生理食塩水注入コントロールと比較して、空腹時血漿電解質およびコルチコステロンは、グルコース注入の8日目に有意に上昇しませんでした（表1）。血漿アルブミンは間を落とし0日と8日目図1Aに示すように、タンパク質摂取の減少と一致するグルコース注入の。正常な肝機能およびインスリン作用と一致して、血漿、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ケトン、トリグリセリド、および非エステル化脂肪酸の減少も測定されました。上の0日、4、および8一晩の絶食後、CIGI高ラットにおける空腹時血漿グルコースおよびインスリン濃度は摂食値（と類似していた図2 のA及びAND3 A）。3 A）。4日目から8 日目までの間に空腹時血漿グルコース濃度が80 mg / dl増加したにもかかわらず（図3 A）、インスリン、C-ペプチド、またはインスリン/ C-ペプチド比の減少はなく、悪化した高血糖を説明していません（図3、 Bおよび C）。インスリンと同様に、血漿アミリンもCIGI-highラットで増加しました（図3D）。

表1

生理食塩水注入ラットおよびCIGI高ラットの生理的空腹時パラメーター

8日目 0日目 生理食塩水 3.3 g?kg -1 ?h -1グルコース ナトリウム、mmol / l 134±2 123±4 123±6 カリウム、mmol / l 4.1±0.3 3.9±0.4 4.7±0.2 塩化物、mmol / l 101±2 99±3 95±3 カルシウム、mmol / l 2.56±0.16 2.35±0.24 1.95±0.12 アラニンアミノトランスフェラーゼ、U / l 32.3±5.6 31.9±2.4 17.9±2 ‡‡ アルブミン、g / l 33±1 29±1 * 24±1 ***、‡ ケトン、mmol / l 0.92±0.29 0.40±0.05 0.11±0.03 ‡ トリグリセリド、mmol / l 0.68±0.09 0.25±0.02 ** 0.32±0.05 * 非エステル化脂肪酸、mmol / l 1.21±0.19 0.50±0.23 0.26±0.08 ** コルチコステロン、nmol / l 648±141 322±115 363±61 データは、各分析物の血漿濃度の平均±標準誤差です。n = 0日目の 8?12 回の実験、8日目の生理食塩水注入ラットの3?4回の実験、8 日目のグルコース注入ラットの8?11回の実験。CIGI、慢性、静脈内グルコース注入。

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図3

CIGI高ラットのグルコース恒常性の空腹時パラメーター。A：空腹時血漿グルコース。n = 51（0日目）、26（4日目）、および42（8日目）。B：空腹時血漿インスリン。n = 22（0日目）、19（4日目）、および27（8日目）。C：空腹時血漿Cペプチド。n = 16（0日目）、15（4日目）、および14（8日目）。D：空腹時血漿アミリン。n = 12（0日目）、19（4日目）、および30（8日目）。E：空腹時血漿グルカゴン。n = 9（0日目）、9（4日目）、および32（8日目）。F：内因性グルコース産生; n = 10（0日目）、8（4日目）、および21（8日目）。* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001。ボンフェローニの多重比較検定と混合モデル分析を使用した- D、及び2テール不対スチューデントT-検定を使用したEおよびF。

IVGTT（1グラム/ kg）の時血漿グルコース濃度における増分応答は、間に区別できなかった日4及び8グルコースクリアランスがわずかに比べて遅れたが、0日（図4 A）。驚くべきことに、高血糖の悪化にもかかわらず、8日目にCIGI-highラットはIVGTT全体で最高の血漿インスリンレベルを示しました（図4B）。4日目と比較してグルコース刺激β細胞のパフォーマンスの低下を示唆していません。総第一相インスリンは両方で有意に増加した4日目と8日目IVGTTでは、ベースラインのインスリン分泌がすでに高いことを考慮した後、0、4、8 日目でグルコースに対する急性反応に差はありませんでした（図4 C）。グルコース注入動物のIVGTT中に測定された血漿インスリンの大部分は、基礎分泌の増加の結果でした。基礎インスリンは、4日目に総インスリンAUCの87％、8日目に 77％を占めましたが、0日目には21％でした（図4 D）。ベースラインを超える総AUCインスリン分泌は、8日目の CIGI高ラットで高くなる傾向がありました（図4、DおよびE）。したがって、グルコース注入の8?10日後、CIGI-highラットは、基礎インスリン分泌または刺激インスリン分泌のいずれの明らかな減少とも関連しない悪化した高血糖を発症しました。

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図4

静脈内グルコース耐性にCIGI高ラットにおける試験（GTT）0日、4、および8注入。A：血漿グルコース濃度。B：血漿インスリン濃度。でAとB、○= 0日、●= 4日目、および□= 8日目。4日目と8 日目の間のどの時点でもグルコース濃度に差はなかった。C：GTTの最初の15分間のインスリン曲線下面積（AUC）。D：総インスリンAUC。間に有意差がなかった日4とは8。でCとD、によるベースラインのインスリン分泌にバー=インスリンAUCを閉じ、そしてオープンバーは、ベースラインより上のインスリンAUCを=。間のベースライン上の総AUC、ベースラインAUC、またはAUCに有意差がなかった日の4と8が。E：ベースラインを超える総インスリンAUC。* P <0.05。データは、0日目に19回の実験、4日目に18回の実験、8日目に 7回の実験の平均±標準誤差です。有意性は、対応のない両側スチューデントt検定によって決定されました。

4日目、絶食CIGI高ラットを適切に抑制血漿グルカゴン濃度を有し、EGP（抑制図3、E及びFを）。しかし、8日目までに、CIGI-highラットの血漿グルカゴン濃度は5倍に増加し、EGPは3倍に増加しました（図3、EおよびF）。0日目と比較して4 日目と8 日目の両方で肝臓グリコーゲン含量が増加する傾向がありました（図5A）; ただし、注入の過程で肝トリグリセリド、長鎖CoA、またはジアシルグリセロール含量に有意な差はありませんでした（図5、B ? D）。

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図5

CIGI高ラットの肝臓内代謝産物。A：グリコーゲン（毎日n = 5）。2尾の対応のないスチューデントt検定による4日目と8 日目の間に有意差はありませんでした。B：トリグリセリド[ n = 6（0日目）、7（4日目）、および14（8日目）]。C：アシル-CoA（n =毎日5）。D：ジアシルグリセロール（n =毎日5）。間にまたがるバー日4及び8は、を参照してPの分散の1ウェイ分析からの値の概要。* P<0.05、** P <0.01。

グルコース注入は、糖新生酵素の変動に関連しています。 糖新生の調節に関与するいくつかの酵素の肝発現とタンパク質レベルを研究した。グルコース注入の過程でグルコース-6-ホスファターゼまたはフルクトース-1,6-ビスホスファターゼのmRNAに変化はありませんでした（図6、AおよびB）。PEPCK-CのmRNAおよびタンパク質は、注入を続けると減少しました（図6、C、E、およびF）。一方、PEPCK-MはmRNAで上昇し、程度は低いもののタンパク質レベル（図6、D、E、およびG）。

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図6

肝臓の糖新生酵素の発現とタンパク質。：グルコース-6-ホスファターゼ（G-6- P ASE）式[ N = 7（0日）、7（4日目）、および9（8日目）]。B：フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ（FBPase）の発現[ n = 6（0日目）、6（4日目）、および10（8日目）]。C：肝細胞質ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK-C）mRNA [ n = 7（0日目）、7（4日目）、および13（8日目）]。D：肝臓ミトコンドリアホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK-M）mRNA [ n = 6（0日目）、6（4日目）、および13（8日目）]。E：PEPCKタンパク質の測定に使用するウェスタンブロット。GAPDHを負荷コントロールとして使用。F：肝PEPCK-Cタンパク質（毎日n = 3）。G：肝臓PEPCK-Mタンパク質（n = 3毎日）。A - F、分散の1ウェイ分析（バーが及ぶ計算した0日目に8の個々の比較で）0日対4日目及び0日対日8ボンフェローニの多重比較検定で1方向ANOVAによります。2尾の対応のないスチューデントt検定による4日目と8 日目の間に有意差はありませんでした。個々のバーの統計は、Bonferroniの多重比較検定による一元配置分散分析による0日目との比較を示しています。* P <0.05; ** P <0.01。

グルカゴンは、CIGI-highラットの高血糖の本質的な原因です。 血漿グルカゴン濃度の増加につながるα細胞機能障害がCIGI-highラットのEGP増加の原因であるかどうかを評価するために、8日目に高血糖CIGI-highラットにグルカゴンに対するモノクローナル抗体を投与しました（36）。抗体投与前の空腹時血漿グルコースおよびインスリンレベルは同一でした（図7、AおよびB）。対照抗体を投与されたCIGI-highラットでは、治療後に血漿グルコースとインスリン濃度が徐々に上昇しました。劇的な対照的に、6時間以内に抗グルカゴン抗体は血漿グルコース濃度を平均70 mg / dl減少させ、改善は24時間で110 mg / dlの減少まで続いた。したがって、グルカゴンを中和した結果は、抗体投与24時間後の対照群と治療群の血漿グルコース濃度の相対的な300 mg / dlの差でした（それぞれ479±33対172±4 mg / dl、P = 0.0002）。グルカゴンの中和に応じて、血漿インスリンも低下する傾向がありました（図7 B）、グルカゴンの減少の有益な効果は、β細胞活性の増強を通じて媒介されなかったことを示唆しています。血漿グルコースおよびインスリン濃度の抗体処置後24時間でのレベルと同一であった4日目（上の抗体172±10対178±6ミリグラム/ dlの後にグルコース4日、P = 0.64;インスリン抗体242±36対198±後4日目の 39μU/ ml 、P = 0.52）。グルコース注入の速度は変化していなかったため、これは高血糖を説明するインスリン抵抗性の増加に反しており、グルカゴンの過剰分泌を示唆しています。グルカゴンを遮断すると、6時間後に対照動物と比較して肝臓のグルコース産生が60％減少しました（図7 C）、内因性グルコースの出現率の合計が約20％減少します。抗グルカゴン抗体治療は、発現レベルでPEPCK-Mの有意な減少と関連していましたが、PEPCK-Cも減少傾向にありました（図8）。

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図7

高血糖CIGI-highラットでの抗グルカゴン抗体による治療に対する反応。A：抗体処理の前後の血漿グルコース濃度。B：治療前後の血漿インスリン濃度。C：治療の6時間後の肝臓のグルコース出力。でAとB、白いバー=対照群、および=抗グルカゴン抗体処置群バーを閉じました。で- C、N、対照群における24時間後= 9 6時間後及び6、及びN =抗グルカゴン抗体群における24時間後の7 6時間後及び7。有意性は、対応のない両側スチューデントt検定で評価されました。* P<0.05; *** P <0.001; †† P <0.01対ベースラインの対照群; ‡‡‡ ベースラインでのP <0.001 vs抗グルカゴン抗体治療群。

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図8

抗グルカゴン抗体治療後の肝PEPCK発現。A：PEPCK-C式（各グループでn = 6）。B：肝PEPCK-M式（各グループでn = 7）。* P <0.05。

ディスカッション

T2Dへの進行は、一般に、血液中のグルコースの出現速度が適切なグルコースクリアランスを仲介するβ細胞の能力を超えると発生すると考えられています。私たちの実験は、グルコース代謝回転の長期にわたる増加が他の点では正常な動物の膵島α細胞およびβ細胞機能を損なう可能性があるかどうかを確立するために設計されました。連続静脈内ブドウ糖注入により、正常で健康な成体のスプラーグドーリーラットのブドウ糖の出現率が空腹時レベルの5?8倍に増加し、適応期間後に一貫して高血糖が沈殿しました。驚くべきことに、高血糖症は空腹時またはグルコース刺激インスリン分泌の減少と関連していませんでした。むしろ、高血糖は、血漿グルカゴン濃度の不適切な増加と、その結果としてのEGPの増加に続きました。グルカゴンの作用を抗グルカゴン抗体でブロックするとこれらの欠陥が逆転し、血漿グルカゴン濃度の増加がEGPと高血糖の増加の原因であることが示されました。グルコースを慢性的に注入したラットでのこれらの観察は、1）過剰なEGPをシミュレートする膵島の基礎需要の増加は、インスリン分泌の測定可能な低下の前の血漿グルカゴン濃度の不適切な増加と関連しています2）血漿グルカゴン濃度のわずかな増加はEGPを十分に増加させて高血糖を引き起こし、3）高血糖が発生する可能性がありますインスリン分泌の検出可能な減少がない場合。

空腹時高血糖は糖尿病（の基本的特徴である1）、それは主に過度のEGP（に起因することができる4、10、27、43、45）。EGPが増加すると、基底島のワークロードも増加します。重度の持続的な高血糖、低インスリン血症、インスリン抵抗性、および血漿グルカゴン濃度の上昇を誘発するために、グルカゴンを毎日複数回注射する4匹の50％膵切除イヌで250 mg / dl以上の血漿グルコース濃度をクランプする2週間が必要でした（17）。特に、これらの犬の残りの島は、β細胞量が減少したが、正常なグルカゴン免疫反応性があった。これらの状況下では、高グルカゴン血症の直接的な原因またはその結果として生じる糖尿病への寄与を特定することはできませんでした。他の点では正常で健康なラットの肝インスリン抵抗性に関連するEGPの増加をシミュレートするために、CIGIモデルが利用されました。デュアルチャンネルスイベルに接続された2本の別々の静脈ラインを使用することにより、1つのカテーテルからの血液サンプリングを維持しながら、10日以内に他のカテーテルから一定の注入を維持できました。このモデルの利点は、基礎となる高脂血症、高コルチコステロン血症、肥満、膵島欠損症（膵部分切除術による）、孤立したβ細胞欠損症、レプチンシグナル伝達障害、

他の研究室は、正常ラットにおける慢性グルコース注入（最初の2-4日にわたって同様の適応生理機能を実証している20、40、41）。ヘイガー等。（15）0日目と比較して3日目でインスリン感受性の低下を示し、グルコース注入中のインスリン感受性をグルコース注入開始前の0日目と直接比較することはできませんでしたが、データはこれらの所見と一致しています。我々の研究と同様に、他のグループは、注入が徐々に血漿グルコース濃度を減少させるグルコースに対するその適応を示していると同時に間の改善されたインスリン感受性を示唆し、血漿インスリン濃度を低下させる日1及び4は、グルコース処理速度の増加に関連するかどうかのグルコース出現の割合で減少します。注入の8日目までにグルコース恒常性が失われると、EGP、グルコース、およびインスリンが増加し、肝臓のインスリン抵抗性の増加または代替のインスリン非依存性糖新生経路が活性化されたことが示唆されました。抗グルカゴン抗体治療の6時間以内にEGPが抑制され、グルコースとインスリンが4日目のレベルに戻ったため、我々のデータは後者の可能性を示唆しています。これは、抑制されたケトン生成（表1）およびPEPCK-Cのダウンレギュレーション（図6、C、E、およびF）によってさらにサポートされています）肝インスリンシグナル伝達の少なくともいくつかの経路が無傷のままであることを示す。

グルコース刺激インスリン分泌の適度可逆障害はまた、短期的なグルコース注入ラットの膵臓灌流（中in vitroで観察されている9、11、22 - 25）。注目すべきことに、我々の研究の4日目では、CIGI-highラットは、0日目と比較してIVGTT中にin vivoでインスリン分泌を増加させ、4日目から8 日目まで減少は測定されませんでした（図4、B - E）。実際、ラットは、4日目と比較して8日目に IVGTT中にインスリン分泌が増加する傾向を示しました。。8日目までにβ細胞の機能は正常血糖を維持するのに明らかに不十分ですが、我々のデータは、これがβ細胞によるグルコース刺激インスリン分泌の絶対的な失敗の結果ではないことを示唆しています。

他の研究室（によって実証と同様のパターン次の22、23、40、41）、初期適応フェーズの後、両方CIGI高-低及びラットは互いに区別できなかった新たな定常状態の血漿グルコースに達した（図。2 A）。CIGI-lowラットは、グルコース注入の持続期間を通じてこの新しい定常状態を維持しましたが、CIGI-highグループは、同一の静的および動的インスリン分泌にもかかわらず、ますます高血糖になりました。高血糖は多くの組織に有害であることは明らかですが、原則として、高血糖は糖尿病がすでに発生していることの特徴であるため、高血糖を引き起こすには何らかの事前のin辱または欠乏が必要です。CIGI-highラットの4日目と8 日目の比較は有益でした。4日目はグルコース恒常性が徐々に改善する時期を表し、8日目は大部分のラットにとって悪化のポイントをマークします。驚くべきことに、4日目と8 日目の間で空腹時血漿インスリン濃度に減少はありませんでした。同じインスリンでIVGTT中に同じグルコースチャレンジに（ベースラインを超える）応答0日、4、および8β細胞による動的なインスリン分泌が無傷のままであったことを示唆しています。T2Dの初期段階でグルコースの出現が増加する状況で血漿グルコース濃度を正常化できないことが、真のβ細胞機能不全を表すのか、それとも異なる用量反応関係の存在を表すのかはよく理解されていません。我々の研究では、正常な血漿グルコースレベルを維持するには循環インスリンが不十分であったが、インスリングルカゴン抗体後に血漿グルコースが増加してもインスリン分泌は低下せず（図3、AおよびB）、血漿グルコースが低下しても増加しなかった治療（図7、AおよびB）。その結果、刺激されたインスリン分泌と静的なインスリン分泌の両方で、グルコースの変化に対するある程度の反応性が維持されました。アミリンがインスリンと共分泌されるため予想されるように、アミリンレベルも4および8 日目に増加しました。注入の8日目に血漿アミリン濃度が増加する傾向があったが、有意差はなく、アミリン/インスリン比は有意に変化しなかった。4日目と8 日目の間でこれらのデータに変化がないことは、β細胞分泌が血糖の代償不全の時に頑強なままであったという概念を支持します。

8日目に変化しない静的および動的インスリン分泌にもかかわらず、ラットは血漿グルカゴン濃度とEGPの著しい増加を伴い、徐々に高血糖になりました。グルカゴンの調節不全は、1型糖尿病の患者および動物モデルで最もよく研??究されており、その場合、高グルカゴン血症は少なくとも部分的には内因性インスリンによる阻害の喪失に起因すると考えられています（34）。低インスリンの設定では、高血糖症は、逆説的に、グルカゴン分泌（刺激5、21）。しかし、我々の研究では、高血糖と高グルカゴン血症は、血漿インスリン濃度が変化しない状況で徐々に発達しました。慢性的なグルコース注入は高グルカゴン血症につながる可能性があることを実証しましたが、このモデルでのこのメカニズムは不明のままです。インスリン分泌の損失は原因ではないようですが、他の可能性のある病因には、膵島内シグナル伝達の変化（例えば、β細胞からのGABAまたは亜鉛、α細胞からのグルタミン酸、δ細胞からのソマトスタチン）、変化した中枢または末梢自律入力（6、8、29）、または潜在的にα細胞インスリン抵抗性。グルカゴン放出の不適切な制御は1型糖尿病でよりよく特徴づけられていますが、2型糖尿病患者は高血糖（42）および不明確なメカニズムによる高炭水化物負荷（31）によるグルカゴン分泌の抑制も低下しています。私たちの研究では、4日目と8 日目で血漿コルチコステロン濃度に差はありませんでした（表1）、両方とも研究開始時よりも低かった。循環カテコールアミンは測定されなかったが、コルチコステロンの減少は全身ストレス反応に反すると主張している。このような高グルカゴン血症は、ヒト糖尿病の発症における重要な特徴である可能性があるため、グルカゴン分泌の増加のメカニズムを明らかにするには追加の研究が必要です。

グルカゴン機能の妨害は、動物の高血糖を予防または修正します。グルカゴン受容体ノックアウトマウスは、低血糖値と改良されたグルコース耐性（持って12、32）、及び障害グルカゴン分泌を有するマウスは、高脂肪食誘発性高血糖（から保護されている14）。抗グルカゴン抗体（とグルカゴンの作用をブロックする13、36）、またはグルカゴン受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（26）糖尿病の食事誘発性および遺伝性げっ歯類モデルの高血糖症を修正します。同様に、我々の研究では、抗グルカゴン抗体による治療により血漿グルコースが適応レベルに回復し、EGPが60％減少しました。血漿グルコース濃度が低下すると、血漿インスリンレベルが低下しました。したがって、インスリン分泌の増加は、血糖の改善を説明できません。グルカゴンは、さまざまな実験設定でインスリン放出を増強することができますが、これと我々のモデルとの生理学的関連性は不明です。原則として、グルカゴン刺激インスリン分泌の低下は、抗グルカゴン抗体投与後のインスリンレベルの低下を説明できる可能性があります。しかし、より可能性の高い説明は、減少したEGPおよび血漿グルコースに対するβ細胞の適切な応答です。

抗グルカゴン抗体治療の24時間後、血漿グルコースおよびインスリンレベルは4日目と同じでした。グルコース注入速度と血漿グルコースおよびインスリンはこれらの各時間で同じであったため、全身インスリン抵抗性は高血糖の発生を説明できません。私たちのデータは、Lauryらによる研究を裏付けています。（20）、ラットの4日間の慢性ブドウ糖クランプ中に170 mg / dlでブドウ糖を継続的にランプするにはブドウ糖注入速度の増加が必要であることを示し、注入初期のこれらの動物の全身インスリン感受性の改善を示唆しました。私たちの動物の血漿トランスアミナーゼレベルが低いと、肝臓の炎症が除外され、0日目と図8は、ケト形成のインスリン媒介抑制がCIGIラットで無傷のままであることを示しています。同様に、血漿トリグリセリドと遊離脂肪酸の減少は、インスリンによる無傷の脂質生成抑制を示唆しており、膵島機能障害における脂肪毒性の役割に反しています。

正常な肝インスリン感受性のいくつかの証拠にもかかわらずEGPが上昇した理由を調査するために、糖新生の調節酵素の肝発現を評価しました。グルコース-6-ホスファターゼもフルクトース-1,6-ビスホスファターゼmRNA（図6、AおよびB）も4日目と8 日目の間で有意に変化しませんでした。対照的に、保存された肝臓のインスリンシグナル伝達を維持しながら、インスリンレベルが上昇するにつれて、4日目と8 日目にPEPCK-Cレベルが徐々に抑制されました。8日目PEPCKによって触媒される酵素反応は、乳酸、アラニン、グルタミン、ピルビン酸などの重要な糖新生基質からの糖新生に不可欠であるため、EGPの増加は明らかなパラドックスをもたらしました。抗グルカゴン抗体治療は、すでに低いPEPCK-C mRNAのわずかではあるが有意な減少をもたらしましたが、タンパク質発現に変化はありませんでした。増加した糖新生フラックスの代謝源の潜在的な説明は、PEPCK-M発現とグルカゴンレベルおよびEGPとの相関関係です。PEPCK-Mは一般に、げっ歯類で構成的に発現していると考えられており、グルカゴンまたはインスリンの影響を受けていません。インスリンとグルカゴンの組み合わせまたは他のシグナルがPEPCK-Mの発現を変化させることができるかどうかは、未定です。37）。

要約すると、CIGI-highラットは、他の根本的な異常がない場合に、膵島機能および血糖コントロールに対するグルコース負荷の増加の影響を研究するためのモデルシステムを提供します。これらの点で健康な若いラットを研究することからの重要な洞察は、インスリン分泌の損失も、全身インスリン抵抗性の明らかな増加も、空腹時および食後高血糖の発症と関連していなかったことです。重要なことは、ベースラインと比較してグルコース注入ラットの肝臓グリコーゲン、アシル-CoA、およびトリグリセリドの違いに向かう傾向がありましたが（図5、A ? C）、4日目と8 日目には違いがありませんでした、ラットが高血糖の悪化に進行していたとき。グルコースの連続注入によるグルコース出現率の増加は、グルコース恒常性の喪失につながるのに十分なsufficient辱でした。驚くべきことに、β細胞の作業負荷の増加は、インスリン分泌の絶対的な減少と関連していませんでした。おそらく、動物はインスリンレベルが変化せずにますます高血糖になったため、β細胞機能に相対的な欠陥がある可能性があります。高血糖の発症は、不適切に上昇した血漿グルカゴン濃度と関連しており、これはEGPを増加させるのに十分であり、高血糖をもたらしました。このモデルでグルカゴンの作用をブロックすると、高血糖が逆転し、EGPが抑制され、血漿インスリン濃度が低下しました。

助成金

これらの研究は、米国公衆衛生局（R01-DK-40936、R01-DK-71071、K08-DK-80142、P30-DK-45735、P30-DK-34989、T32-GM-07205、およびUL1-RR-024139）および米国糖尿病協会（1-09-RA-86）。

開示事項

著者は、金銭的またはその他の利益相反を宣言しません。

謝辞

イェール大学のT. May、S。Skowronek、Y。Kosover、およびA. Groszmannの専門的な技術支援に感謝します。

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